菌液pcr正确但是测序不对,长了菌但是菌落pcr没阳性

菌液pcr正确但是测序不对,长了菌但是菌落pcr没阳性

1.可以将选定的细菌摇出来，菌落PCR条带与目标条带相符，但是菌液测序失败是什么原因？ 2、菌液测序出现信号弱的情况，说明测序模板与引物无法配对，或者配对能力差，导致信号弱甚至无信号。 细菌样品中没有信号表明细菌溶液的浓度太低或什至无活性，或者载体的拷贝数低，导致提取的质粒浓度低且测序信号不足。 载体

解决方案：如果是空载体，则重新消化载体，再次进行连接转化；如果引物不匹配，分析序列并更换合适的引物对；如果PCR产物大小错误，则重复PCR扩增并使用正确的大小。 该产物被连接并转化。 ②如果使用该序列进行菌落PCR假阳性较高，可能是因为PCR的循环次数过大。在我们实验室，一般对于高拷贝数质粒，循环次数不会超过25，一般使用25。 误报的关键原因在于连接过程

●﹏● 菌落PCR中没有条带，剩下的16条被用来继续构建载体。然后，令人震惊的事情又发生了。有两个基因，A4和A6。它们在Ampresistance平板上生长，但菌落PCR中没有条带（这两天我已经挑了28个细菌）。但是，分析的菌落PCR中假阳性的数量很高，可能是因为PCR中进行的循环次数太大。我们实验室一般对待高拷贝数的质粒，循环次数不会超过25，一般使用25。误报的关键原因在于连接时的比较过程。

2.26SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。与细菌不同，酵母一般可以通过26SrRNA（约600bp）一步鉴定到种的水平。 26SrRNA基因序列扩增引物：正向NL-1：(5'-GCATATCPCR有假阳性，应以酶切结果为准！有时个别克隆的酶切位点存在突变，不能使用！以质粒为模板

∪▂∪ 对于菌落PCR，您可以选择载体的正向引物，并使用您自己的目标片段的反向引物进行PCR。如果同时使用目标片段的正向和反向引物，则可能会出现假阳性。 要么你的片段GC含量太高，要么是多聚结构，导致测序错误。解决方法：如果是空载体，重新酶切载体，重新进行连接转化；如果引物不匹配，分析序列并替换。 一对合适的引物；如果PCR产物大小错误，请重新运行PCR扩增并使用正确大小的产物。