qpcr复孔数据不一致,qpcr重复孔差异一般在多少

qpcr复孔数据不一致,qpcr重复孔差异一般在多少

●▂● 可能原因：采样错误；标准品降解；模板浓度或抑制剂过高；引物或探针不良；PCR酶灵敏度低和活性降低。 解决方法：标准样品体积应大于2ul，引物应预先混合后分孔，定期校准移液器，尽量选择正确的溶液。在qPCR反应中，反应本身有很多物理因素会影响信号检测，从而造成孔间差异。 数据差异。 例如：PCR反应板背景信号不均匀、PCR管盖厚度不同、同一反应体系点胶时不同等。 ROX™可以提供帮助

多个孔的较大差异可能是由于上样前移液不均匀或不同移液器吸头的差异造成的。建议在添加样品（包括内参+目的）之前使用同一移液器吸头充分混匀。 另外，30以上的目的基因表达水平较低，且更容易出现多个孔洞，这可能是因为ROX浓度与机器型号不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图。 【注】您可以在仪器上将参考染料设置从ROX更改为NONE，取消ROX的校准功能，并检查放大曲线是否恢复正常，以确定是否是ROX引起的。 6.熔炼

●▂● 我目前正在做qPCR，引物特异性没有问题。目前配件使用得很好，重复ct值相差太大，请同志们帮忙。比如，转录组测序完成后，我经常用QPCR来验证结果。 然而，验证结果往往存在一致的上调和下调趋势的基因表达。 我们先来分析一下两者不一致的原因。 1.可能原因：1）样本比较关系颠倒（AvsB

多孔间重复性差一般出现在以下两种情况：（1）CT值很大，如CT≥30，重复性差属正常现象。 这种现象符合泊松分布，即当有效模板量很少时，模板与引物的碰撞是随机的，直接导致重复孔之间CT值的差异。5）排除上述所有可能后，如果结果仍然不一致，首先检查QPCR结果是否正确。 例如，如果您只选择基因，如果您确定QPCR没有问题，则使用它作为标准。 如果你选择20个基因，结果会不一致